一、引言

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）因其高效的表達(dá)能力、良好的穩(wěn)定性和安全性，在生物制藥領(lǐng)域尤其是重組蛋白和抗體藥物的生產(chǎn)中占據(jù)核心地位。CHO細(xì)胞發(fā)酵工藝是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟以確保產(chǎn)品的高產(chǎn)率和質(zhì)量。從培養(yǎng)基選擇與配制、種子細(xì)胞準(zhǔn)備、接種與培養(yǎng)條件、發(fā)酵過程控制、溶氧與pH調(diào)節(jié)、營養(yǎng)補(bǔ)料策略、代謝物監(jiān)測(cè)與分析，以及收獲與分離純化等方面，全面闡述CHO細(xì)胞發(fā)酵工藝。

二、培養(yǎng)基選擇與配制

1.  基礎(chǔ)培養(yǎng)基：常選用富含氨基酸、維生素、無機(jī)鹽和必需生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如Ham's F-12或DMEM/F-12混合培養(yǎng)基，以支持CHO細(xì)胞的快速生長和高效表達(dá)。

2. 營養(yǎng)成分優(yōu)化：根據(jù)CHO細(xì)胞的特定需求和產(chǎn)物表達(dá)特性，可添加適量血清（如胎牛血清）或無血清替代品，以及特定的生長因子

 （如IGF-1）、激素（如胰島素）等，以優(yōu)化細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)。

3.  pH調(diào)節(jié)：培養(yǎng)基初始pH通常設(shè)定在7.0-7.4之間，使用緩沖鹽（如HEPES）維持pH穩(wěn)定。

三、種子細(xì)胞準(zhǔn)備

1.  細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)增：從液氮中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，經(jīng)過幾次傳代培養(yǎng)，逐步擴(kuò)大規(guī)模至所需接種量。

2. 細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)：通過細(xì)胞形態(tài)觀察、活力檢測(cè)（如臺(tái)盼藍(lán)染色）、無菌檢查等手段確保種子細(xì)胞質(zhì)量。

四、接種與培養(yǎng)條件

1.  接種密度：根據(jù)細(xì)胞類型和工藝需求，選擇合適的接種密度，一般控制在(1-5) × 10^5 cells/mL。

2.   培養(yǎng)條件：包括溫度（36.5-37.5°C）、攪拌速度（以提供適當(dāng)?shù)幕旌虾蜌怏w交換）、氣體流量（主要為CO?和O?的混合氣體）等，需根據(jù)細(xì)胞生長情況適時(shí)調(diào)整。

五、發(fā)酵過程控制

1.細(xì)胞生長監(jiān)測(cè)：定期取樣測(cè)定細(xì)胞密度、活率和代謝活性，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2. 溫度與攪拌控制：維持適宜的溫度和攪拌條件，以促進(jìn)細(xì)胞生長和代謝。

六、溶氧與pH調(diào)節(jié)

1.  溶氧控制：通過調(diào)整氣體流量和攪拌速度，維持發(fā)酵液中溶解氧（DO）在適當(dāng)水平（通常高于20%），以滿足細(xì)胞呼吸需求。

2.   pH調(diào)節(jié)：根據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的pH值，適時(shí)添加酸堿溶液（如NaOH、HCl或CO?），維持pH在設(shè)定范圍內(nèi)。

七、營養(yǎng)補(bǔ)料策略

1.   定期補(bǔ)料：根據(jù)細(xì)胞生長和代謝物消耗情況，適時(shí)補(bǔ)充葡萄糖、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，以延長細(xì)胞生長周期和提高表達(dá)量。

2. 智能補(bǔ)料：采用在線監(jiān)測(cè)和反饋系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的精準(zhǔn)補(bǔ)給，提高補(bǔ)料效率。

八、代謝物監(jiān)測(cè)與分析

1.  代謝產(chǎn)物檢測(cè)：定期檢測(cè)發(fā)酵液中的乳酸、氨、氨基酸等代謝產(chǎn)物，評(píng)估細(xì)胞代謝狀態(tài)。

2. 目標(biāo)產(chǎn)物分析：利用HPLC、ELISA等方法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量和純度，確保產(chǎn)品質(zhì)量。

九、收獲與分離純化

1.  發(fā)酵液收獲：當(dāng)細(xì)胞密度下降、表達(dá)量不再顯著增加時(shí)，結(jié)束發(fā)酵過程，收集發(fā)酵液。

2.  分離純化：采用離心、超濾、層析（如親和層析、離子交換層析）等技術(shù)，從發(fā)酵液中分離并純化目標(biāo)蛋白。

3.   產(chǎn)品檢測(cè)與儲(chǔ)存：對(duì)純化后的產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)（如純度、活性、穩(wěn)定性等），合格后進(jìn)行分裝、貼簽和儲(chǔ)存。