生物技術(shù)研究者追求的兩個主要目標(biāo)，一是新型生物產(chǎn)品的開發(fā)，另一就是為傳統(tǒng)的或新生生物產(chǎn)品，尋求更經(jīng)濟的生產(chǎn)方式。近十年來，利用遺傳工程技術(shù)來生產(chǎn)一些重要的生物藥物，是生物技術(shù)領(lǐng)域中迅速發(fā)展的一個重要方向。在這一研究領(lǐng)域里，如何創(chuàng)造更經(jīng)濟、更有效的方法，來提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性和產(chǎn)品的市場競爭力，已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的科學(xué)家們所關(guān)注的焦點問題。
   利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重要的生物藥物，在人類文明史上具有劃時代的意義。由于生產(chǎn)成本和生產(chǎn)率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥物生產(chǎn)過程的優(yōu)化已經(jīng)成為一個重要問題。它包括以下六個方面∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(如可溶的胞內(nèi)積累、胞內(nèi)聚合積累、周質(zhì)積累或胞外積累)的確定；(3)重組基因最大表達的分子策略；(4)細胞生長和生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)化；(5)發(fā)酵條件的優(yōu)化；后處理過程的優(yōu)化。只有這六個方面都以實現(xiàn)高生產(chǎn)率為目標(biāo)，整個生產(chǎn)過程的最優(yōu)化才能實現(xiàn)。

(一)細胞生長環(huán)境的優(yōu)化策略
要提高細胞密度和生產(chǎn)率，首先需要對微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境進行優(yōu)化，包括生長培養(yǎng)基的組成，培養(yǎng)物理參數(shù)(pH、溫度和攪拌)及產(chǎn)物誘導(dǎo)條件。優(yōu)化這些參數(shù)的目的在于保證細胞生長處于最適的環(huán)境條件之下，避免營養(yǎng)物過量或不足、防止產(chǎn)物降解以及減少有毒產(chǎn)物的形成。
1．培養(yǎng)基組成的優(yōu)化
培養(yǎng)基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微營養(yǎng)物如維生素和微量元素，這些營養(yǎng)物的濃度與比例，對實現(xiàn)生產(chǎn)重組微生物的高密度發(fā)酵是很重要的。例如，過量的Fe2+和CaCO3與相對低濃度的磷酸鹽可促進黃曲霉生產(chǎn)L-蘋果酸；鏈霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產(chǎn)能力可提高10倍之多；在重組微生物達到高細胞密度后，限制磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素b的產(chǎn)率顯著提高。此外還發(fā)現(xiàn)，限制精氨酸的濃度雖然會抑制細胞的生長，但比起精氨酸充足時細胞生長優(yōu)良的情況，其重組a-淀粉酶的產(chǎn)量可提高2倍。
培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的種類對重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵也非常重要。一般地，當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有酵母膏時，重組蛋白不穩(wěn)定；而當(dāng)流加培養(yǎng)基中含有蛋白胨時，大腸桿菌不能再利用其所產(chǎn)生的乙酸。將酵母膏和蛋白胨都加入流加培養(yǎng)基中，不但所生產(chǎn)的重組蛋白非常穩(wěn)定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機制。
恒化技術(shù)可用于優(yōu)化精氨酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌X90的生長培養(yǎng)基。使該菌株以0.4 h-1的比生長速率在含精氨酸的基本培養(yǎng)基上生長，待培養(yǎng)達到穩(wěn)定狀態(tài)后，在恒化器內(nèi)分別加入氨基酸、維生素和微量元素來考察這些物質(zhì)對菌體生長和精氨酸合成的影響。結(jié)果表明，由于氨基酸生物合成途徑的末端產(chǎn)物抑制作用，加入某些氨基酸后，細胞生長反而受到抑制。加入NH4Cl后細胞量則出現(xiàn)了戲劇性的增長。而添加維生素對菌體生長基本上沒有任何影響。通過計算生物量對每種基質(zhì)的產(chǎn)率，最終可以確定高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，在此優(yōu)化培養(yǎng)基上，大腸桿菌X90細胞密度可達到92 g/L，同時形成56 mg/L的胞外重組蛋白酶。
2．特殊營養(yǎng)物的添加
在某些情況下，向培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質(zhì)能提高生產(chǎn)率。這些營養(yǎng)物的作用有可能是作為產(chǎn)物的前體，也有可能是阻止產(chǎn)物的降解，例如，在培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(一種由許多芳香族氨基酸組成的蛋白)時添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大約2倍；在培養(yǎng)重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)b-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩(wěn)定性顯著提高。其原因可能是由于宿主細胞產(chǎn)生的多種胞外蛋白酶的活性被抑制，從而防止了重組蛋白的降解。
在生長培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)有時還能以一種未知的機制提高生產(chǎn)率。例如，在搖瓶培養(yǎng)Micromonospora cbersina時添加碘化鈉可使dynemicin A的產(chǎn)量提高35倍，但在小型反應(yīng)器中卻無法重復(fù)這一結(jié)果。
3．限制代謝副產(chǎn)物的積累
培養(yǎng)條件的控制對代謝副產(chǎn)物的形成影響甚大。在分批或流加培養(yǎng)中，某些營養(yǎng)物的濃度過高均會導(dǎo)致Crabtree效應(yīng)的產(chǎn)生。在這種效應(yīng)下，釀酒酵母會產(chǎn)生乙醇，大腸桿菌則會產(chǎn)生過量乙酸，一旦生成乙酸，細胞生長及重組蛋白的生產(chǎn)均會受到抑制。大腸桿菌形成乙酸的速度依賴于細胞的生長速度和培養(yǎng)基的組成。業(yè)已確證，如果在培養(yǎng)基中添加復(fù)合營養(yǎng)物(如大豆水解物)，則會增加乙酸的積累量。針對如何減輕由于乙酸積累而產(chǎn)生的負面影響，眾多研究者進行了大量工作，如利用循環(huán)發(fā)酵技術(shù)來限制乙酸在重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)中的積累。近來也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的抑制作用。如在培養(yǎng)基中添加10 mg/L的甘氨酸能顯著促進大腸桿菌合成重組a-淀粉酶和b-內(nèi)酰胺酶，并能刺激酶從周質(zhì)向培養(yǎng)基中釋放，但此時仍有乙酸伴隨生成。
 

(二)培養(yǎng)模式

由于許多營養(yǎng)物在高濃度下對細胞有抑制作用，而為了達到高細胞密度，又必須供給大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，濃縮營養(yǎng)物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反應(yīng)器中。為此產(chǎn)生了多種形式的補料策略，它可以簡單到線性補料，也可以復(fù)雜到利用數(shù)學(xué)模型計算得出的策略來控制補料速率。具體來說，培養(yǎng)模式的選擇主要依賴于以下三個因素∶(1)所培養(yǎng)細胞的具體代謝行為；(2)利用抑制性底物合成目的產(chǎn)物的潛力；(3)誘導(dǎo)條件以及測量細胞培養(yǎng)各項參數(shù)的能力。
1．大腸桿菌流加發(fā)酵策略
大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養(yǎng)時最關(guān)鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產(chǎn)生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴重抑制細胞生長和重組蛋白的生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，即使葡萄糖濃度只有0.25～0.5 g/L，大腸桿菌仍會產(chǎn)生乙酸。因此，高細胞密度發(fā)酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應(yīng)器中底物濃度處于較低的水平。營養(yǎng)物最好以它們的消耗速率加入反應(yīng)器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處于饑餓狀態(tài)。
近年來已經(jīng)報道了多種控制大腸桿菌流加培養(yǎng)中流加速率的方法，其中大多數(shù)是將流加速率與一種物理參數(shù)間接耦合(如溶氧、pH或CO2釋放速率)。有學(xué)者將溶氧控制在一個預(yù)定值上以保證較低的生長速率，結(jié)果乙酸產(chǎn)生很少，最終細胞干重達到110 g/L，并發(fā)現(xiàn)較低的比生長速率還有利于重組蛋白的高表達。在另一個控制低比生長速率的高細胞密度培養(yǎng)中，研究者采用先指數(shù)流加葡萄糖、銨鹽和無機鹽，后采用廣義線性流加的培養(yǎng)策略，有效地防止了乙酸的積累，重組大腸桿菌的細胞密度達到66 g/L，通過溫度誘導(dǎo)可在胞內(nèi)形成19.2 g/L的活性重組蛋白。
如果將葡萄糖濃度控制在一個不致于產(chǎn)生毒性的足夠低的水平上，也可以使細胞在不存在限制性基質(zhì)的情況下迅速生長到高細胞密度。這種控制策略對儀器的要求較高。Kleman等采用在線葡萄糖分析儀，以微生物對葡萄糖的需求來決定葡萄糖和其它營養(yǎng)物的流加速率，這一算法能夠在產(chǎn)物誘導(dǎo)階段中根據(jù)細胞生長的變化自動調(diào)整流加速率。培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌 MV1190，其質(zhì)粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最終細胞干重達到39 g/L，產(chǎn)生1.7 g/L可溶的活性蛋白。
2．重組酵母的流加發(fā)酵
酵母中廣泛用于遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有以下缺點∶(1)重組蛋白生產(chǎn)的水平較低；(2)質(zhì)粒不穩(wěn)定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出現(xiàn)的，因為這會抑制重組蛋白的形成。近來研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也具有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細胞密度狀態(tài)下表達和分泌鼠表皮生長因子的能力。培養(yǎng)每基因組含有19個拷貝數(shù)的巴斯德畢赤氏酵母，最終可獲得447 mg/L胞內(nèi)重組蛋白；而培養(yǎng)釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7 mg/L。
通過先指數(shù)流加，后采用基于CO2釋放和RQ值的線性流加控制方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細胞干重達到80～90 g/L，并分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養(yǎng)釀酒酵母，細胞干重和重組蛋白的產(chǎn)量僅分別為25 g/L和20 mg/L。即使將釀酒酵母的生長速率維持在0.12～0.18 h-1，也將形成10～13 g/L的乙醇，因而導(dǎo)致產(chǎn)率降低。但釀酒酵母產(chǎn)乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一個復(fù)雜的流加系統(tǒng)，將酵母的生長速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生產(chǎn)最大而乙醇的生成最小。
3．流加培養(yǎng)的控制
一個好的流加控制系統(tǒng)必須避免兩種傾向∶一是流加過量，補料組分在反應(yīng)器中積累從而對細胞生長和產(chǎn)物形成產(chǎn)生抑制；二是流加不足，這可能會導(dǎo)致細胞必需營養(yǎng)物的缺乏。計算機技術(shù)的迅猛發(fā)展，為流加培養(yǎng)的控制提供了更有效的手段。近年來，應(yīng)用計算機技術(shù)來監(jiān)測和控制發(fā)酵過程的研究屢見報道。由于現(xiàn)代計算機技術(shù)的幫助，人們能夠采用多種生長參數(shù)和數(shù)學(xué)模型來控制流加培養(yǎng)中營養(yǎng)物的添加，從而使復(fù)雜的控制系統(tǒng)得以實現(xiàn)。在各種人工智能技術(shù)中，模糊推理(fuzzy reasoning)是應(yīng)用最廣的一種。模糊邏輯控制(fuzzy logic control)部分依賴于數(shù)學(xué)生長模型，也采用“語言定義的規(guī)則系統(tǒng)”(linguistically defined rules system)來幫助系統(tǒng)響應(yīng)發(fā)酵過程的非線性和動態(tài)行為。Alfafara等在流加培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的研究中，采用一個模糊邏輯控制系統(tǒng)來控制葡萄糖的流加速度，對系統(tǒng)進行優(yōu)化后谷胱甘肽的比產(chǎn)生速率達到6.2 h-1。目前，在流加培養(yǎng)中應(yīng)用模糊邏輯控制技術(shù)的最大問題在于如何減少底物和產(chǎn)物濃度振蕩所需的調(diào)整次數(shù)。自適應(yīng)模糊邏輯控制算法的發(fā)展可望對此有所幫助。

   (三)誘導(dǎo)策略

對于許多帶有誘導(dǎo)型啟動子的重組微生物，只有將生長期和產(chǎn)物形成期分開才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養(yǎng)中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導(dǎo)直至細胞生長已達到高密度來實現(xiàn)。此外，如果質(zhì)粒穩(wěn)定并且產(chǎn)物對培養(yǎng)物無毒，那么可以用重復(fù)補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)來提高生產(chǎn)率。有學(xué)者采用重復(fù)補料分批培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)釀酒酵母，每24 h更換50%的培養(yǎng)基，持續(xù)30 d，其產(chǎn)物(hirudin)的產(chǎn)量可比連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)提高3倍。

如果誘導(dǎo)物和產(chǎn)物對細胞都有毒性，那么應(yīng)當(dāng)人為地將誘導(dǎo)期和生長期分開。對于這種情況，兩級連續(xù)培養(yǎng)是最適宜的培養(yǎng)方式?？刂频谝还薜臈l件，使細胞生長處于最適狀態(tài)之下，而誘導(dǎo)與產(chǎn)物形成則發(fā)生在第二罐中。例如，在恒化器中培養(yǎng)一株能產(chǎn)b-內(nèi)酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發(fā)酵液導(dǎo)入第二罐中，構(gòu)成一個兩級培養(yǎng)系統(tǒng)。第二罐中添加營養(yǎng)物以及IPTG作為誘導(dǎo)物。結(jié)果獲得300 mg活性b-內(nèi)酰胺酶(相當(dāng)于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統(tǒng)至少可以穩(wěn)定運行50 d。另一相似的系統(tǒng)被用于培養(yǎng)大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養(yǎng)在恒濁器中進行，對第二罐進行熱誘導(dǎo)，結(jié)果獲得了比分批發(fā)酵高6倍的比生產(chǎn)率。研究者還嘗試將生產(chǎn)重組蛋白的兩級連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)與親和色譜柱相組合，試圖實現(xiàn)重組蛋白生產(chǎn)和純化的連續(xù)化。但由于技術(shù)上的一些原因，這種組合還未得到成功。
比生長速率對細胞生長和產(chǎn)物形成均有重要作用。經(jīng)常會遇到的情況是，最適于細胞生長的比生長速率卻并不適于產(chǎn)物的形成或其它特性的實現(xiàn)。我們在培養(yǎng)面包酵母時發(fā)現(xiàn)，比生長速率為0.2 h-1時細胞產(chǎn)率最高，而比生長速率為0.178 h-1時酵母發(fā)酵活力最佳。針對這一現(xiàn)象我們提出了一個兩階段控制比生長速率的流加培養(yǎng)策略，結(jié)果在一個反應(yīng)器中實現(xiàn)了高發(fā)酵活力與高細胞產(chǎn)率的統(tǒng)一。 (四)細胞循環(huán)發(fā)酵 從反應(yīng)器角度來考慮獲得高細胞密度，通常采用的是細胞循環(huán)生物反應(yīng)器。這種反應(yīng)器利用一種切向流或中空纖維過濾器從醪液中分離細胞，細胞返回容器，無細胞醪液則以給定速率連續(xù)轉(zhuǎn)移，同時代之以新鮮培養(yǎng)基。利用細胞循環(huán)技術(shù)，可使細胞保留在反應(yīng)器中并達到高細胞密度，而毒性廢產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物則不斷轉(zhuǎn)移，這可以延遲或防止由細胞生長或產(chǎn)物形成引起的反饋抑制。細胞循環(huán)生物反應(yīng)器能夠適用于多種機體和生產(chǎn)系統(tǒng)，但它的應(yīng)用也存在許多限制，主要包括∶(1)作用于進入過濾單元的細胞的剪應(yīng)力太大；(2)系統(tǒng)的放大存在許多實際困難。
操作細胞循環(huán)生物反應(yīng)器時必須考慮兩個因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環(huán)速率(指通過過濾系統(tǒng)的培養(yǎng)基速率)。稀釋率的大小影響細胞的生長速率，不同的實驗?zāi)康膶ο♂屄实囊笠膊煌桓叩难h(huán)速率可使組分混合均勻，特別適用于細胞容易凝聚或成團的情況。但循環(huán)速率過高會使作用在細胞上的剪切力過高，也會導(dǎo)致過濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時確定合適的稀釋率與循環(huán)速率，這也是限制細胞循環(huán)技術(shù)應(yīng)用的一個重要因素。
細胞循環(huán)技術(shù)可望獲得高的體積生產(chǎn)率，這對產(chǎn)物的提取非常有利。近年來循環(huán)發(fā)酵技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)細胞代謝物，如燃料酒精和有機酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌細胞干重達到145 g/L，其重組青霉素?；干a(chǎn)率比分批培養(yǎng)提高了近10倍。對于活細胞即為所希望的產(chǎn)物的培養(yǎng)，細胞循環(huán)發(fā)酵也能發(fā)揮作用。如在食品工業(yè)中，為生產(chǎn)牛奶，奶酪和酸乳酪需培養(yǎng)不同的乳桿菌，采用細胞循環(huán)生物反應(yīng)器可以很容易地提高這些生物體的的密度。
在多種控制手段的幫助下，目前人們已經(jīng)能很容易地獲得超過100 g/L的細胞密度。但已有的研究結(jié)果表明，與最適生物量形成所對應(yīng)的生長條件通常會導(dǎo)致較低的比生產(chǎn)率。例如，用細胞循環(huán)反應(yīng)器生產(chǎn)2,3-丁二醇，生物量提高了大約6倍，但體積生產(chǎn)率只提高了2～3倍。同樣，流加培養(yǎng)可以使鏈霉菌的細胞干重達到43 g/L，但蛋白酶活為零，而當(dāng)細胞干重為18 g/L時蛋白酶活卻高達3500 U/mL。我們在研究中也經(jīng)常遇到類似問題。要解決這一問題，一方面應(yīng)當(dāng)研究如何促進重組蛋白的高效表達和提高重組菌株的穩(wěn)定性，另一方面要研究與高細胞密度相關(guān)聯(lián)的高水平產(chǎn)物的形成條件。